相差顯微鏡的光學元件應(yīng)用與技術(shù)解析

相差顯微鏡（Phase Contrast Microscope）是一種基于光波相位變化的光學成像技術(shù)，由荷蘭物理學家Frits Zernike于20世紀30年代發(fā)明，其核心目標是將透明樣本（如活細胞、未染色組織）的相位差轉(zhuǎn)換為可見的明暗對比，主要用于觀察未染色標本。

我們都知道，相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位指在某一時間上，光的波動所達到的位置。傳統(tǒng)明場顯微鏡中，一般由于被檢物體（如不染色的細胞）所能產(chǎn)生的相差太小，肉眼很難分辨，只有在變相差為振幅差（明暗差）之后才能被區(qū)分，而相差顯微鏡則很好解決了這一難題，成為生物學、醫(yī)學和材料科學中不可或缺的觀測工具。

二、相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)及工作原理

相差顯微鏡通過以下四個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)實現(xiàn)相位對比成像：

相差物鏡：內(nèi)含相位板，調(diào)制直射光與衍射光的相位差。

轉(zhuǎn)盤聚光器：集成環(huán)形光闌，提供匹配物鏡的環(huán)形照明。

合軸調(diào)中望遠鏡：校準環(huán)形光闌與相位板的同軸性。

綠色濾光片：優(yōu)化單色光成像，減少多色光相位誤差。

當光線穿過透明樣本時，會因樣本厚度或折射率差異產(chǎn)生相位延遲（相位差），但人眼無法直接感知相位變化。相差顯微鏡通過以下兩步實現(xiàn)相位到強度的轉(zhuǎn)換：

環(huán)形照明：聚光鏡下方的環(huán)形光闌形成環(huán)形光束，均勻照射樣本。  

相位調(diào)制：物鏡后焦平面的相位板對直射光（未散射）和衍射光（散射）施加不同的相位延遲（通常為λ/4）和光強衰減，使兩者干涉后形成明暗對比。  

2. 光學系統(tǒng)架構(gòu)

相差顯微鏡的光路由以下核心模塊構(gòu)成：  

照明系統(tǒng)：光源→聚光鏡透鏡組→環(huán)形光闌→樣本。  

成像系統(tǒng)：物鏡透鏡組（含相位板）→輔助透鏡→目鏡或相機。  

二、光學系統(tǒng)與工作原理的深度解析

1. 環(huán)形照明的實現(xiàn)：轉(zhuǎn)盤聚光器

結(jié)構(gòu)設(shè)計：轉(zhuǎn)盤聚光器包含多個環(huán)形光闌（對應(yīng)不同倍率物鏡），通過旋轉(zhuǎn)切換光闌尺寸。每個光闌為金屬薄片上的環(huán)形透光孔，孔徑與物鏡相位環(huán)嚴格匹配，其作用便是形成空心錐形照明光束，使直射光（未與樣本作用）與衍射光（經(jīng)樣本散射）在物鏡后焦平面分離，為相位調(diào)制創(chuàng)造條件。

2. 合軸調(diào)中望遠鏡的功能

校準流程：取下目鏡，插入合軸調(diào)中望遠鏡，通過調(diào)節(jié)聚光器的對中旋鈕，使環(huán)形光闌的像與物鏡相位環(huán)完全重合。精度要求在環(huán)形光闌與相位環(huán)的偏移需小于5微米，否則會導致對比度下降或成像不均。

3. 綠色濾光片的技術(shù)價值

核心作用：單色化照明：濾光片通常選擇綠色（峰值波長550±10 nm），限制光源波長范圍，避免多色光因波長差異引起的相位延遲波動（相位差Δφ=2πΔn·t/λ，波長λ變化會干擾Δφ的一致性），主要用于提升分辨率，人眼對綠光敏感，且綠光波長適中（500–600 nm），有助于在可見光范圍內(nèi)平衡分辨率和對比度。

技術(shù)參數(shù)：

窄帶濾光片，半高寬（FWHM）≤20 nm，透光率>90%（如BP550-15）。

鍍膜工藝：硬質(zhì)氧化物多層膜（如TiO?/SiO?交替鍍層），確保耐久性與抗眩光性能。

三、核心光學元件的協(xié)同設(shè)計

1. 相差物鏡：相位板與透鏡組的集成

相位板類型：

正相差（Dark Contrast）：直射光延遲λ/4，吸收70%強度，背景暗、樣本亮。

負相差（Bright Contrast）：衍射光延遲λ/4，背景亮、樣本暗。

物鏡透鏡組設(shè)計：

低色差物鏡：采用螢石（CaF?）與BK7玻璃組合，校正色差至<1 nm（在550 nm處）。

高NA物鏡：使用超高折射率玻璃（如LaSFN9，n=1.88）提升數(shù)值孔徑（NA=1.4）。

相位板鍍膜：相位延遲層SiO?膜厚精確控制550 nm波長下，λ/4對應(yīng)膜厚≈138 nm，誤差<±5 nm。

吸收層：鉻膜厚度10–30 nm，光強衰減率可調(diào)（70%–90%）。

2. 轉(zhuǎn)盤聚光器的光學匹配性

環(huán)形光闌參數(shù)：

環(huán)形寬度與物鏡倍率相關(guān)（例如40X物鏡對應(yīng)環(huán)寬約0.5 mm）。

光闌透光區(qū)鍍增透膜（MgF?），降低雜散光反射。

聚光鏡NA匹配：
聚光器數(shù)值孔徑需略高于物鏡NA（如物鏡NA=1.3，聚光器NA=1.4），確保全孔徑照明。

3. 綠色濾光片的系統(tǒng)優(yōu)化

與光源的匹配：鹵素燈或LED光源需預(yù)裝紅外截止濾光片，避免熱量影響樣本，再疊加綠色濾光片實現(xiàn)單色化。

相位對比增強：單色綠光可減少物鏡色差校正壓力，使相位板設(shè)計更專注于單一波長（550 nm）的精準調(diào)制。

（激埃特原創(chuàng)圖）

四、光學元件的性能標準與應(yīng)用案例

1. 國際標準與測試方法

相位板校準：ISO 19012-4規(guī)定相位延遲量需通過激光干涉儀檢測（精度λ/100）。

濾光片性能：符合DIN 19011透射光譜測試標準，確保波段準確性。

2. 典型應(yīng)用場景

活細胞成像（40X物鏡，NA=0.65，綠色濾光片）：

參數(shù)要求：物鏡工作距離≥0.6 mm，相位板吸收率80%，避免光毒性。

案例：HeLa細胞分裂過程觀測，時間分辨率達30幀/秒。

材料表面檢測（20X物鏡，長工作距離WD=10.5 mm）：

濾光片選擇：窄帶綠光（550/10 nm）減少金屬表面反光干擾。

相差顯微鏡的四大特殊結(jié)構(gòu)并非孤立存在，而是與光學鏡片深度協(xié)同：

環(huán)形光闌+聚光鏡透鏡：確保照明光路與相位板精確匹配。

綠色濾光片+物鏡鍍膜：通過單色化提升相位調(diào)制精度。

合軸望遠鏡+高精度機械結(jié)構(gòu)：維持光路穩(wěn)定性。

未來，隨著鍍膜技術(shù)（如原子層沉積ALD）與計算光學的發(fā)展，綠色濾光片可能被可調(diào)諧液晶濾光片取代，相位板延遲量可動態(tài)調(diào)整，進一步拓展相差顯微鏡的應(yīng)用邊界。

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