熒光光譜學(xué)分析
1、技術(shù)簡(jiǎn)介
當(dāng)常溫物質(zhì)經(jīng)入射光照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即激發(fā)并發(fā)出出射光，那么這種出射光就被稱之為熒光。熒光測(cè)量是利用靈敏的探測(cè)器和高效率的濾光片，將檢測(cè)樣本發(fā)出的微弱信號(hào)光和高強(qiáng)度的激發(fā)光區(qū)分出來(lái)，并通過(guò)探測(cè)器對(duì)區(qū)分出來(lái)樣本的微弱信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。
圖1 激發(fā)熒光原理圖
圖2 發(fā)射熒光能級(jí)圖
圖3 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)重疊現(xiàn)象
2、應(yīng)用說(shuō)明
熒光激發(fā)光譜可以通過(guò)有效的熒光激發(fā)波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行表現(xiàn)，并能夠得到熒光轉(zhuǎn)化效率。利用穩(wěn)定可靠的激發(fā)源和發(fā)光二極管作為激發(fā)光，雖然大多數(shù)情況下，激發(fā)波長(zhǎng)和物質(zhì)的發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生重疊，但當(dāng)一個(gè)短波長(zhǎng)的激發(fā)光在一點(diǎn)激發(fā)物質(zhì)，我們就能在物質(zhì)發(fā)散的其他位置觀察到比激發(fā)光更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光，以此區(qū)分出長(zhǎng)波為熒光發(fā)射波長(zhǎng)，短波段為激發(fā)波。
熒光光譜學(xué)分析對(duì)于調(diào)查性研究和分析性科學(xué)的應(yīng)用是一個(gè)主要的工具。
自然環(huán)境：寶石鑒定分析，礦石分析，葉綠素分析，原油殘留等;
法醫(yī)鑒定：指紋和血液檢測(cè)，分析纖維組織和其他物質(zhì);
熒光體溫度測(cè)量；
基礎(chǔ)研究：激光誘導(dǎo)熒光研究分子的電子結(jié)構(gòu)和相互作用，燃燒，等離子，以及流體的濃度;
生物：分子檢測(cè)，細(xì)胞進(jìn)程，細(xì)胞分類(lèi);
醫(yī)學(xué)診斷：分析癌癥細(xì)胞，葡萄糖測(cè)定，DNA測(cè)序，細(xì)胞計(jì)數(shù)，凝膠電泳。
圖4 深海水母的熒光
圖5 熒光色素標(biāo)記的癌變細(xì)胞
3、典型產(chǎn)品和配置
熒光檢測(cè)配置：
3.1 光譜儀：鑒于熒光較為微弱的特性，通常需要高靈敏度光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，這類(lèi)光譜往往采用背照減薄型CCD，部分還帶有CCD制冷，以保證信噪比。
3.2 反射鏡: 將更多發(fā)散的熒光耦合到光纖內(nèi)。
3.3 聚光透鏡：光纖出射的發(fā)散光，通過(guò)聚光透鏡可以形成平行光，使得入射光效率提高。
3.4激發(fā)光源：激發(fā)光源的選擇具有多樣性，比如LED光源、激光等等。使用LED的中心波長(zhǎng)最好接近激發(fā)光源波長(zhǎng);所選擇激光的強(qiáng)度要能被光譜儀檢測(cè)到，才能保證發(fā)射熒光被檢測(cè)到。如果使用帶寬光源(即連續(xù)光譜光源)，需要添加單色濾光片濾出單色光。
3.5 濾光片：帶通濾光片是窄化激發(fā)光源的最簡(jiǎn)單選擇，該濾光片由長(zhǎng)通和短通兩塊濾光片組成，通過(guò)調(diào)節(jié)短通濾光片的位置，可以實(shí)現(xiàn)單色激發(fā)光。如果熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)未知，客戶可使用可調(diào)線性濾光片，可以設(shè)置帶寬20nm到100nm不等的單色波作為激發(fā)波長(zhǎng)，還可以單獨(dú)使用長(zhǎng)通和短通濾光片，設(shè)置起始波長(zhǎng)和截止波長(zhǎng)。
圖6 帶通濾光片光譜圖
3.6 采樣附件(光纖、熒光反射探頭、比色皿卡槽等)：模塊化的熒光測(cè)量系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于使用單個(gè)激發(fā)光源和檢測(cè)器的情況下，獲得數(shù)據(jù)具有建議性、高效性、即時(shí)性。通過(guò)改變光纖的連接位置，可以實(shí)現(xiàn)0°, 90°和180°的不同收光角度進(jìn)行不同形式的光學(xué)測(cè)量。使用熒光反射探頭，可以直接接觸樣品表面測(cè)量高濃度的液體樣品、固體或者粉末，獲取樣品的熒光散射光。
比色皿卡槽，更換其中的透鏡可以提高樣品熒光的聚集。使用比色皿，可以簡(jiǎn)便高效率地實(shí)現(xiàn)nmol濃度物質(zhì)的熒光測(cè)量。使用配有4通道的比色皿卡槽，由于使用空間耦合的方式，具有高耦合效率。
圖7 比色皿卡槽
3.7光譜儀控制軟件：專用軟件可以讓使用者更好地使用光譜儀進(jìn)行各種應(yīng)用。當(dāng)使用光譜儀控制軟件進(jìn)行熒光測(cè)量時(shí)，經(jīng)常使用到兩種測(cè)量模式：QuickView mode(快速掃描)和Relative Irradiance mode(相對(duì)輻射)。
圖8 熒光檢測(cè)典型配置圖
典型產(chǎn)品：高性能微型光譜，激發(fā)光源，樣品支架
4、應(yīng)用文章
4.1 納米晶體的多個(gè)發(fā)射峰，成像和定量分析
圖9 上轉(zhuǎn)換材料熒光光譜
圖10 不同的光源測(cè)量核殼量子點(diǎn)發(fā)射光譜
4.2 不同受力情況下壓電陶瓷光譜檢測(cè)
圖11 不同受力情況下壓電陶瓷光譜
4.3 測(cè)量?jī)?nèi)嵌蛋白熒光的標(biāo)準(zhǔn)光譜工具;
12 牛血清白蛋白熒光光譜(0.1 mg/mL)
圖13 溶解酶吸光度光譜(0.1 mg/mL)
4.4 硫酸奎寧的熒光檢測(cè)
圖14 硫酸奎寧熒光光譜
4.5 切削油的熒光檢測(cè)
圖15 不同樣品切削油熒光光譜
4.6 使用色氨酸熒光進(jìn)行溶菌酶的構(gòu)象分析
圖16 磷酸鹽緩沖劑天然和變性溶菌酶熒光光譜